 |
| Изменение потенциала поверхности после добавления авидина четко показывает, что произошло связывание. |
Технология микрочипов широко применяется в генетических и молекулярно-биологических исследованиях. В настоящее время в микрочипах взаимодействие между целевой ДНК и иммобилизованным ДНК-зондом (пришитой к поверхности чипа одноцепочечной молекулой ДНК с известной последовательностью) детектируют при помощи флуоресцентной метки. Современные методы создания микрочипов позволяют наносить различные ДНК-зонды на подложку с субмикронной точностью, однако методы считывания подобной точностью не обладают, поэтому на практике используются ячейки размером около 10 мкм.
 |
| Удвоение сигнала при комплементарном связывании образца и ДНК-зонда. |
Технология визуализации поверхности, известная как метод зонда Кельвина (Kelvin probe force microscopy, KPFM), дает возможность изучать взаимодействия между биомолекулами, а в сочетании с методом дип-пен нанолитографии (применяемой при создании ДНК-чипов методики нанесения очень маленького количества определенного вещества в микроскопическую ёмкость) представляет собой аналог технологии ДНК-микрочипов. KPFM позволяет надежно детектировать сигнал при размерах ячейки 250 нм. Таким образом, речь идет уже о наночипах, в которых плотность ячеек в тысячу раз больше, чем в современных микрочипах.
 |
| В случае некомплементарного образца удвоение сигнала не наблюдается. |
В методе KPFM измеряется распределение поверхностного потенциала в исследуемом субстрате. Многие биологические молекулы имеют в своей структуре заряженные участки, например такие, как отрицательно заряженная сахарофосфатная основа молекулы ДНК. При формировании высокоспецифичных комплексов между молекулами происходит перераспределение плотности заряда. Изучая изменение потенциала поверхности образца, можно детектировать взаимодействие между биомолекулами.
 |
| Ячейка ДНК-наночипа, изготовленная методом DPN (АСМ). |
Asher Sinensky и Angela Belcher из Massachusetts Institute of Technology (США) продемонстрировали, что KPFM является удобным и надежным методом считывания сигнала с белковых или ДНК-наночипов. К достоинствам метода относятся: высокое разрешение (<10 нм), высокая чувствительность (<50 нМ), высокая скорость сканирования образца (>1100 мкм/с), возможность различать специфичные и неспецифичные взаимодействия между молекулами. Метод бесконтактный и не требует использования меток, что особенно важно для биологических систем.
Авторы работы представили две модельные системы, имитирующие основные типы биологических чипов. В первом случае изучали взаимодействие молекулы биотина и гликопротеина авидина, аналогичное взаимодействию «антитело-антиген». Биотин был иммобилизован на золотой подложке методом DPN. Изменение потенциала поверхности после добавления авидина четко показывает, что произошло связывание.
Во втором случае авторы исследовали применимость метода KPFM для детектирования ДНК-гибридизации – явления, лежащего в основе ДНК-чипов. В качестве ДНК-зондов ученые использовали 15-нуклеотидные одноцепочечные ДНК, содержащие фрагменты генов сибирской язвы в одном случае и малярии в другом. Согласно ожиданиям, в обоих случаях наблюдалось удвоение сигнала при добавлении образца ДНК, комплементарного ДНК-зонду, и не наблюдалось в случае некомплементарного.
Кроме того...
